人/猴抗I型膠原和II型膠原IgG抗體ELISA試劑盒

Human/Monkey Anti-Type I and Type II Collagen IgG Antibody ELISA Kits with TMB

Catalog # Catalog # 1031T, 1032T, 1033T, 1035T, 2051T, 2052T, 2053T, and 2055T

 產(chǎn)品簡介：

人血清，特別是自身免疫性疾病患者的血清，含有高水平的免疫成分，在ELISA檢測中造成高背景。這些非特異性反應(yīng)是由人血清中的粘附性免疫球蛋白引起的，這些免疫球蛋白通過親水性結(jié)合在塑料板表面，而牛血清白蛋白（BSA）和吐溫20（Tween20）也不能阻斷這些非特異反應(yīng)。由血清樣本本身引起的假陽性反應(yīng)通常被忽略。即使現(xiàn)在，在許多情況下也被認(rèn)為是真正的抗原-抗體反應(yīng)。為了獲得抗原抗體反應(yīng)的真實(shí)值。以下幾點(diǎn)很關(guān)鍵1)選擇合適的阻斷劑，有效的阻斷這類非特異性反應(yīng)。2）用包被孔檢測每個樣品的背景值3）用試劑盒確定的相應(yīng)值減去該背景值。此外，確定二抗的背景值也很重要。Chondrex公司的ELISA試劑盒包含*的阻斷劑，可抑制這些血清成分和塑料表面的疏水性結(jié)合，并通過非包被孔測定背景值。

一般來說，人血清中的膠原對異種抗原（例如：牛或雞I型和II型膠原）高度特異型，并且與其他種類和類型的膠原（包括人膠原）有交叉反應(yīng)（與疾病無關(guān)）。例如：即使是健康正常人的血清抗體也會對不同種類和類型的膠原蛋白發(fā)生反應(yīng)。為了確定血清中特定抗原的抗體水平。Chondrex公司提供各種種屬的I型和II型膠原包被板和無包被板。此試劑盒提供可供2個塊檢測板的試劑量，可用于人和后血清樣本檢測。

試劑盒組分：

 包被板和設(shè)置

 標(biāo)準(zhǔn)ELSIA（Standard ELISA Kit）試劑盒（I型膠原或II型膠原單一種屬）

標(biāo)準(zhǔn)ELISA試劑盒 含5列未包被的8聯(lián)孔作為對照孔，用于評價樣本中的背景值，5列包被了I型膠原或II型膠原的8聯(lián)孔用于檢測膠原抗體的含量。2列標(biāo)準(zhǔn)品。“B”代表作為空白孔，用于檢測由二抗引起的非特異性反應(yīng)。標(biāo)準(zhǔn)品和樣本全部做復(fù)孔。

定制ELISA試劑盒（多種屬膠原）

定制ELISA試劑盒用于檢測人血清中的不同種屬的人I型或II型膠原。此試劑盒含2列未包被孔，2列人，雞，牛II型膠原包被板孔，和2列標(biāo)準(zhǔn)品孔。“B”代表作為空白孔，用于檢測由二抗引起的非特異性反應(yīng)。

用前須知：

1. 推薦標(biāo)準(zhǔn)品和樣本做復(fù)孔檢測。
2. 所有緩沖液用前置于室溫平衡。
3. 20X洗液低溫時可能會有結(jié)晶析出。如果有結(jié)晶析出，將瓶置于溫育水中，直至結(jié)晶全部溶解。
4. 用移液器準(zhǔn)確定量提供的緩沖液，提供額外的緩沖液。
5. 每個步驟結(jié)束后，用封板膜封板，防止蒸發(fā)。
6. 如果只是用部分試劑，請參照操作步驟中的用量，做相應(yīng)的使用量緩沖液配制。未使用的儲液在原包裝管內(nèi)保存，置于-20℃保存。
7. 試劑用完，做生物安全處理

操作流程：

1.加入封閉液：加100ul封閉液（Solution A）到各孔，室溫孵育1小時。

2.制備標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液：未稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品儲液濃度是16U/ml。在250ul的16U/ml的稀釋液中加入250ul的SolutionB-8U/ml，依次制備系列標(biāo)準(zhǔn)品，4,2,1,0.5和0.25U/ml標(biāo)準(zhǔn)品。16U/ml標(biāo)準(zhǔn)品-20℃標(biāo)準(zhǔn)品-20保存，用于下次實(shí)驗(yàn)。

3.制備樣本稀釋液：血清樣本10000 rpm室溫離心3min 去除不容物和脂類。樣本1:100稀釋或用Solution B 稀釋到進(jìn)一步稀釋。例如：取10ul樣本加入0.99ml Solution B(1:100)。作為儲液用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如果可以，樣本可以稀釋到1:200~1:1000。

4.洗液稀釋：50ml 20X稀釋加入950ml雙蒸水（1X稀釋）。用稀釋后的洗液（1X稀釋）至少洗板三次。倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

5.加入標(biāo)準(zhǔn)品和樣本：加入100 ul標(biāo)準(zhǔn)品，SolutionB(空白)和樣本到孔內(nèi)，做復(fù)孔。室溫孵育2小時。

6.洗滌：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

7.加入二抗：用10ml Solution C(溶液C) 溶解1管二抗。或者取一管二抗溶于50ulSolution C(溶液C)中，根據(jù)實(shí)際情況稀釋。加入100ul溶解后的二抗稀釋液到各孔，室溫孵育1小時。

8.洗滌：用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

9.加入HRP標(biāo)記的鏈親和素：取一管HRP標(biāo)記的鏈親和素，溶于10ml鏈親和素稀釋液中。

10.用1X洗液至少洗板三次，倒置微孔板，倒掉孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。不要讓板干燥。

11.TMB:用10ml顯色緩沖液稀釋TMB加入100ul TMB。洗板后立即加入100ul TMB到各孔。室溫孵育15min。

12.終止：加入50ul 2N 硫酸（終止液）到各孔。

13.讀板：讀取450nm處的OD值。如果樣本OD值比大標(biāo)準(zhǔn)品的OD值還高，對樣本稀釋后重新檢測。630nm作為副波長。

計算抗體滴度：

1.計算標(biāo)準(zhǔn)品，空白孔和檢測樣本的均值。

2.樣本值，標(biāo)準(zhǔn)品減去空白值。注：每種抗原有對應(yīng)的空白值。因此，空白孔用于各自的不同抗原。

3.從第二步，用包被孔中的OD值減去未包被孔中的樣本OD值（背景值），除去非特異性反應(yīng)。

4.標(biāo)準(zhǔn)品OD值做縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品值（U/ml）做橫坐標(biāo)。用log/log模式擬合曲線。圖1 為例圖，標(biāo)準(zhǔn)品范圍0.25-16U/ml。

5.通過回歸方程計算樣本中抗體濃度。