細(xì)胞/組織裂解液試劑盒

背景簡(jiǎn)介：

從細(xì)胞或組織中提取到完整的蛋白質(zhì)樣品是影響免疫印跡分析（Western blotting，WB）得到真實(shí)可靠結(jié)果的關(guān)鍵因素之一。在實(shí)際操作中，從細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞器及細(xì)胞核中提取蛋白質(zhì)通常采用去污劑緩沖液（如RIPA 緩沖液）和/或物理破碎（如超聲處理）的方法；尤其，含有0.1% SDS 的RIPA 緩沖液或其替代品（如不含SDS 的NP-40 緩沖液）已作為一種標(biāo)準(zhǔn)方法被廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的裂解。事實(shí)上，RIPA 可以有效溶解和提取分子量小于90 kDa 的中、小分子的絕大部分的蛋白質(zhì)，但其對(duì)于分子量大于90 kDa 的大分子蛋白質(zhì)功效不大。為了更有效地提取到大分子蛋白，許多實(shí)驗(yàn)室會(huì)將RIPA 緩沖液和超聲處理結(jié)合使用，通過超聲打斷DNA，從而降低裂解液的粘稠度。然而，超聲處理會(huì)破壞大分子蛋白。此外，為了保證蛋白質(zhì)在提取的過程中不被細(xì)胞本身的蛋白酶降解和蛋白酶去修飾，各種蛋白酶抑制劑和特異的酶抑制劑要加到RIPA 緩沖液中。例如，為了減少蛋白質(zhì)的降解，需要將蛋白酶抑制劑如PMSF 添加到RIPA 緩沖液中；同樣，為了抑制磷酸酶活性，需加入F化鈉和正釩酸鈉。即便如此，翻譯后修飾的蛋白信號(hào)還是不能得到有效的保護(hù)。

北京博蕾德生物生產(chǎn)的IntactProteinTM 細(xì)胞/組織裂解試劑盒解決了以上問題和缺陷。它可以快速完整的提取細(xì)胞和組織中蛋白質(zhì)，并有效保護(hù)蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾，可以取代現(xiàn)有的RIPA 及其衍生的緩沖液，具有通用性好、應(yīng)用廣泛、實(shí)用高效等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)，該裂解試劑盒在提取蛋白質(zhì)時(shí)無需額外添加蛋白酶、磷酸酶以及其它酶抑制劑，無需超聲波處理，不僅可以完整提取分子量大于90kDa 的大分子蛋白質(zhì)，而且對(duì)小于90kDa 的蛋白質(zhì)分子應(yīng)用同樣有效，大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)流程，節(jié)約時(shí)間和材料成本，從而在源頭上為下游的蛋白質(zhì)分析提供了優(yōu)質(zhì)完整的蛋白質(zhì)樣品。

產(chǎn)品特性：

1）無需添加蛋白酶或其他酶抑制劑或超聲處理。

2）只需混合試劑A 和B；提取過程僅需15 分鐘。

3）接近完整地抽提大分子蛋白質(zhì)；無超聲處理，避免蛋白質(zhì)片段化。

4）保護(hù)蛋白質(zhì)翻譯后修飾（如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化和乙酰化）無損失。

5）適用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞和組織的提取。

儲(chǔ)存：

試劑A 存放于-20°C 冷凍條件，試劑B 存放于室溫或4°C 冷藏條件。

注：若試劑B 在4°C 下長(zhǎng)時(shí)間保存，可能會(huì)出現(xiàn)沉淀，這不影響產(chǎn)品質(zhì)量。當(dāng)移至室溫下，沉淀會(huì)重新溶解。

應(yīng)用：

變性蛋白的提取；免疫印跡分析

貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案：

1）按500 體積組方B 加1 體積組方A（500:1）充分混勻，制備成組方A+B

的工作裂解液IntactProteinTM置于冰上備用。注意：根據(jù)步驟3 提前計(jì)算您需要的裂解液的體積。

2）棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用冰冷的PBS 清洗細(xì)胞2 次。

3）將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板置于冰或冰水中，按5x10?細(xì)胞添加1 mL 裂解液（例如，將300μL 裂解液加入到含有1x10?細(xì)胞的35 mm 培養(yǎng)皿中）。將培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板在冰上再放置5 分鐘，偶爾左右旋轉(zhuǎn)以使裂解液全覆蓋細(xì)胞。

4）裂解5 分鐘后，使用干凈的塑料刮刀將細(xì)胞從培養(yǎng)皿/培養(yǎng)板上刮下，并將裂解物收集到離心管中。

5）充分渦旋混勻裂解物（3×10 秒），并將裂解物置于冰或冰水中再放置10 分鐘以充分裂解。

6）在95℃加熱裂解產(chǎn)物5 分鐘。

7）將裂解產(chǎn)物放在冰或冰水中冷卻3 分鐘。

8）在4°C 以13,000 g 離心裂解產(chǎn)物5 分鐘，將提取的蛋白質(zhì)的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。

9）使用分光光度計(jì)或SDS 兼容的蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)量蛋白質(zhì)濃度。

10）將裂解產(chǎn)物分裝并儲(chǔ)存在-20℃?zhèn)溆谩Ｗ⒁猓喝绻庖哂≯E分析采用還原SDS-PAGE 膠，必須向裂解物中添加終濃度為2–5%的β-巰基乙醇或50 mM DTT，外加0.1%的溴酚藍(lán)。上樣前應(yīng)將樣品在95℃下加熱5 分鐘。

懸浮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案：

1）如貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案步驟1 所述，在使用前立即準(zhǔn)備組方A+B 工作裂解液。

2、將懸浮細(xì)胞以300 g 離心5 分鐘，棄去上清，然后用10 mL 冰冷的PBS 重懸細(xì)胞。再次離心，棄去。

PBS，用移液器將細(xì)胞重懸到殘留的PBS 中。

3、按5x10?細(xì)胞加入1 mL 裂解液，通過移液器充分混勻，然后置于冰或冰水中5 分鐘。

4、按照貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案中的步驟5-10 進(jìn)行操作。

組織蛋白抽提方案：

1、如貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案步驟1 所述，在使用前立即準(zhǔn)備組方A+B 工作裂解液。

2、在液氮中，使用研缽和杵將組織研磨成細(xì)顆粒。

3、按照1 g 組織使用3 mL 裂解液的比例，將冷凍組織粉末加入裂解液中。

4、按照制造商的說明使用勻漿器對(duì)組織進(jìn)行勻漿。（注：勻漿會(huì)加熱樣品，勻漿時(shí)務(wù)必始終將管子底部放在冰上或冰水中）。

5、在冰上孵育勻漿樣品須> 15 分鐘以達(dá)到充分裂解（注：如果實(shí)驗(yàn)同時(shí)有多個(gè)樣品，請(qǐng)將所有勻漿樣品放在冰上，直到完成最后1 個(gè)樣品）。

6、最后一個(gè)樣品勻漿15 分鐘后，在4℃下以13,000 g 離心10 分鐘。將提取的蛋白質(zhì)的上清液轉(zhuǎn)移到干凈的離心管中。

7、按照貼壁細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方案中的步驟6-10 進(jìn)行操作。

產(chǎn)品訂購(gòu)：

細(xì)胞/組織裂解液試劑盒

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